花椒及其制品中麻味物質(zhì)的含量測定-液相色譜法
A.1 適用范圍
本方法適用于花椒及其制品中麻味物質(zhì)（以羥基-α-山椒素計(jì)）的含量測定。
A.2 試劑
A.2.1甲醇（分子式 CH3OH）：分析純。
A.2.2無水乙醇（分子式 CH3CH2OH）：分析純。
A.2.3 羥基-α-山椒素（CAS：83883-10-7， 分子式：C16H25NO2，分子量：263.38， 純度＞98%）。
A.3 儀器
A.3.1 分析天平：感量 0.0001g 和 0.00001g。
A.3.2 超聲波清洗器（功率：500W）。
A.3.3 高速離心機(jī)：≥4500r/min。
A.3.4 液相色譜儀，配紫外檢測器。
A.4 儀器參考條件
表 1 儀器參考條件
A 相：水 | B 相：甲醇 | 波長：268nm | ||
柱溫：35℃ | 流速：0.8mL/min | 進(jìn)樣量：5μL | ||
色譜柱：C18 柱, 柱長 250mm, 內(nèi)徑 4.6mm, 粒徑 5μm, 或等效色譜柱。 | ||||
流動(dòng)相梯度洗脫程序 | ||||
時(shí)間/min | A (%) | B (%) | ||
0.00 | 45.0 | 55.0 | ||
1.00 | 45.0 | 55.0 | ||
20.00 | 20.0 | 80.0 | ||
27.00 | 5.0 | 95.0 | ||
28.00 | 45.0 | 55.0 | ||
30.00 | 45.0 | 55.0 | ||
注：本液相條件為參考條件，可根據(jù)具體色譜分離度適當(dāng)調(diào)整。
A.5 實(shí)驗(yàn)步驟
A.5.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
準(zhǔn)確稱取羥基-α-山椒素 10mg（精確至 0.01mg），用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至 10mL 棕色容量瓶中，定容至刻度，搖勻，即得每 1mL 含 1mg 羥基-α-山椒素的對照品儲備溶液；準(zhǔn)確吸取上述儲備溶液 1mL 置 10mL 容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，搖勻，即得每 1mL 含 0.1mg 羥基-α-山椒素對照品使用溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。
A.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制
準(zhǔn)確吸取上述羥基-α-山椒素對照品使用溶液適量，用無水乙醇配制成 0～100μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用，可根據(jù)儀器靈敏度適當(dāng)調(diào)整濃度范圍），將標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液分別注入液相色譜儀中，測定相應(yīng)的峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
A.5.3 樣品測定
花椒和花椒粉：取混勻的樣品粉末（過孔徑 0.95±0.05mm 篩，約 20 目）約 0.3g，精密稱定，置錐形瓶，加入無水乙醇 80mL，超聲提取 15 分鐘，放冷后轉(zhuǎn)移至 100mL 容量瓶并定容至刻度。搖勻后取適量提取液于 4500r/min 離心 5min。精密量取上清液 1mL，置 10mL 量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，過 0.45μm 濾膜，作為供試品溶液。將供試品溶液注入液相色譜儀中，測定相應(yīng)的峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中羥基-α-山椒素的濃度，按公式（1）計(jì)算花椒和花椒粉中麻味物質(zhì)（以羥基-α-山椒素計(jì)）含量。稀釋倍數(shù)可根據(jù)樣品含量適當(dāng)調(diào)整。
花椒油：取混勻的樣品約0.3g，精密稱定，置錐形瓶，加入無水乙醇80mL，超聲提取15 分鐘，放冷后轉(zhuǎn)移至 100mL 容量瓶并定容至刻度。搖勻后取適量提取液于 4500r/min 離心5min，取上清液過 0.45μm 濾膜，作為供試品溶液。將供試品溶液注入液相色譜儀中，測定相應(yīng)的峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中羥基-α-山椒素的濃度，按公式（1）計(jì)算花椒油中麻味物質(zhì)（以羥基-α-山椒素計(jì)）含量。稀釋倍數(shù)可根據(jù)樣品含量適當(dāng)調(diào)整。
花椒提取物：取混勻的樣品約 0.3g，精密稱定，置錐形瓶，加入無水乙醇 80mL，超聲提取 15 分鐘，放冷后轉(zhuǎn)移至 100mL 容量瓶并定容至刻度。搖勻后取適量提取液于 4500r/min 離心 5min。精密量取上清液 1mL，置 50mL 量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，過 0.45μm 濾膜，作為供試品溶液。將供試品溶液注入液相色譜儀中，測定相應(yīng)的峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中羥基-α-山椒素的濃度，按公式（1）計(jì)算花椒提取物中麻味物質(zhì)（以羥基- α-山椒素計(jì)）含量。稀釋倍數(shù)可根據(jù)樣品含量適當(dāng)調(diào)整。
A.6 計(jì)算
試樣中麻味物質(zhì)的含量按公式（1）計(jì)算：
式中：
X ——試樣中待測組分的含量，單位為克每百克（g/100g，以羥基-α-山椒素計(jì)）；
c ——試樣溶液中待測組分的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；
v ——樣品經(jīng)無水乙醇提取后的定容體積，單位為毫升（mL）；
m ——試樣的稱樣量，單位為克（g）；
f ——無水乙醇提取定容后的稀釋倍數(shù)； 計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。
A.7 精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的 10%。
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